Summary
Bocharov A. Alternatively spliced interleukin-4 protein, interleukin-4 delta2, is naturally secreted T cells.
An alternatively spliced isoform of IL-4 mRNA that omits exon 2 (IL-4д2) was previously described. It was reported that the total levels of combined IL-4 + IL-4д2 mRNAs and IL-4/IL-4д2 mRNA ratios change in patients with scleroderma, asthma, and various infections. Natural IL-4д2 protein was not previously studied because most commercial anti-IL-4 antibodies (Ab) do not react with IL-4д2. We established mammalian expression systems (HEK293 stably transfected or infected with recombinant adenoviral constructs) producing naturally processed (folded and glycosylated) human IL-4 or IL-4д2. By screening a library of commercial anti-IL-4 Abs, we identified a selective Ab reacting exclusively with IL-4, and an indiscriminate Ab reacting equally with IL-4 and IL-4д2. PBMC and T lymphocyte (> 95% purity) cultures from 3 donors with allergic asthma and 3 controls were stimulated with PMA/ionomycin for 24 hrs. The supernates were immunodepleted of wild-type IL-4 using four cycles of depletion with the selective antibody. These immunodepleted supernates were negative in ELISAs with the selective anti-IL-4 Ab. However, the IL-4-depleted supernates from asthmatics, but not controls, were positive in ELISAs with the indiscriminate antibody that now detected only IL-4д2. The levels of IL-4д2 were 5 to 10 fold lower than the levels of IL-4 in the initial undepleted supernates. Thus, IL-4д2 is naturally produced not only in the mRNA form, but also as a secreted protein.
Key words: interleukin-4д 2, immunoprecipitation, T-lymphocytes, allergic asthma.

Резюме
Бочаров А. А. Продукция и секреция альтернативного сплайс-варианта интерлейкина-4, интерлейкин-4 дельта 2, Т-лимфоцитами.
Альтернативный сплайс-вариант интелейкина-4, интерлейкин-4 дельта 2, ранее был описан только в форме мРНК. Продукция и секреция альтернативной формы белка ИЛ-4д2 не была описана ранее в связи с тем, что большинство коммерческих анти-ИЛ-4 антител не реагируют с ИЛ-4д2. Скрининг коммерчески доступных анти-ИЛ-4 антител позволил выявить селективные антитела, которые способны взаимодействовать только с ИЛ-4 и антитела реагирующие, как с ИЛ-4 так и с ИЛ-4д2. Культуры Т-лимфоцитов периферической крови, выделенные от доноров с аллергической астмой и здоровых людей стимулировали ФМА/иономицином в течение 24 часов. Супернатанты использовали для иммунопреципитации интелейкина-4 с селективными анти-ИЛ-4 антителами. Концентрации ИЛ-4 в супернатантах Т-лимфоцитов определяли до и после иммунопреципитации методом ИФА. В супернатантах Т-лимфоцитов контрольной группы после иммунопреципитации ИЛ-4 не обнаруживался, в то время как исследование супернатантов Т-лимфоцитов от пациентов с астмой показало положительную реакцию в ИФА при использовании неселективных антител даже после 3 циклов иммунопреципитации ИЛ-4. Этот факт позволил сделать обоснованное предположение о наличии в супернатантах ИЛ-4д2. Уровни ИЛ-4д2 были в 5-10 раз ниже, чем уровни ИЛ-4 в непреципитированных супернатантах. Таким образом, установлено, что альтернативный сплайс-вариант интерлейкина-4, интерлейкин-4 дельта 2, экспрессируется в Т-лимфоцитах не только в форме мРНК, но и на уровне белка.
Ключевые слова: интерлейкин-4 делта 2, иммунопреципитация, Т-лимфоциты, аллергическая астма.
 

Резюме
Бочаров О. А. Продукція і секреція альтернативного сплайс-варіанту інтерлейкіна-4, інтерлейкін-4 дельта 2, Т-лімфоцитами.
Альтернативний сплайс-варіант інтерлейкіна-4, інтерлейкін-4 дельта 2, раніше був описаний лише у формі мРНК. Продукція і секреція альтернативної форми білка ІЛ-4д2 не була описана раніше у зв'язку з тим, що більшість комерційних анти-ІЛ-4 антитіл не реагують з ІЛ-4д2. Скринінг комерційно доступних анти-ІЛ-4 антитіл дозволив виявити селективні антитіла, які здатні взаємодіяти тільки з ІЛ-4 і антитіла, що реагують як з IL-4 і з IL-4д2. Культури Т-лімфоцитів периферичної крові, виділені від донорів з алергічною астмою і здорових людей стимулювали ФМА/іономіціном протягом 24 годин. Супернатанти використовували для імунопреципітаціі інтелейкіна-4 з селективними анти-ІЛ-4 антитілами. Концентрації ІЛ-4 в супернатантах Т-лімфоцитів визначали до і після імунопреціпітаціі методом ІФА. В супернатантах Т-лімфоцитів контрольної групи після імунопреципітаціі ІЛ-4 не виявлявся, в той час як дослідження супернатантів Т-лімфоцитів від пацієнтів з астмою показало позитивну реакцію при використанні неселективних антитіл навіть після 3 циклів імунопреципітаціі ІЛ-4. Цей факт дозволив зробити обґрунтоване припущення про наявність в супернатантах ІЛ-4д2. Рівні ІЛ-4д2 були в 5-10 разів нижче, ніж рівні ІЛ-4 в непреципітованих супернатантах. Таким чином, встановлено, що альтернативний сплайс-варіант інтелейкіна-4, інтерлейкін-4 дельта 2, експресується в Т-лімфоцитах не тільки у формі мРНК, а й на рівні білка.
Ключові слова: інтерлейкін-4 дельта 2, імунопреціпітація, Т-лімфоцити, алергічна астма.
Рецензент: д.мед.н., проф.І.В.Лоскутова

УДК 612.017.1.08

National University of Pharmacy (Kharkov)

Ukraine, 61002, Kharkov, 53, str. Pushkinska

Национальный фармацевтический университет (Харьков)

61002, г. Харьков, ул. Пушкинская, 53

University of Maryland School of Medicine

References
1. Arinobu Y. Antagonistic effects of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4delta2, on IL-4 activities in human monocytes and B cells / T. Otsuka, B. White, K.Izuhara [et al.] // Cell Immunol. - 1999. - V. 191, № 2. - Р. 161-167.
2. Atamas SP. An alternative splice variant of human interleukin-4, IL-4delta2, inhibits interleukin-4 stimulated T cell proliferation / J. Choi, VV. Yurovsky, B. White // J. Immunol. - 1996. - V. 156, № 2. - Р. 435-441.
3. B cell stimulatory factor-I (interleukin 4) activates macrophages for increased tumoricidal activity and expression of Ia antigens / R. M. Crawford, D. S. Finbloom, J. Ohara [et al.] // J. Immunol. - 1987. - V. 139, № 1. - Р. 135-141.
4. Dheda K. In vivo and in vitro studies of a novel cytokine, interleukin 4 delta 2, in pulmonary tuberculosis / K.Dheda, J.S. Chang, R.A. Breen [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2005. - V. 172, № 4. - Р. 501-508.
5. Dheda K. Expression of a novel cytokine, IL-4delta2, in HIV and HIV-tuberculosis co-infection / K.Dheda, J.S. Chang, R.A. Breen [et al.] // AIDS -2005. - V. 19, № 15. - P. 1601-1606.
6. Feghali C. A. Human recombinant interleukin-4 induces proliferation and interleukin-6 production by cultured human skin fibroblasts / C.A. Feghali, K.L. Bost, D.W. Boulware, L.S. Levy // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1992. - V. 63, № 2. -P. 182-187.
7. Glare E.M. The usefulness of competitive PCR: airway gene expression of IL-5, IL-4, IL-4delta2, IL-2, and IFN-gamma in asthma / E.M.Glare, M. Divjak, M.J. Bailey, E.H. Walters // Thorax. - 2001. - V. 56, № 7. - P. 541-548.
8. Huang-Pin Wu. The interleukin-4 expression in patients with severe sepsis / Huang-Pin Wu, Chia-Ling Wu, Chian-Kuang Chen [et al.] // J. of Critical Care. -2008. -V. 23, № 4. - P. 519-524.
9. Illera V. A. Apoptosis in splenic B lymphocytes: regulation by protein kinase C and IL-4 / V. A. Illera, C. E. Perdandones, L. L. Stunz [et al.] // J. Immunol. -1993. - V. 151, № 6. - P. 2965-2973.
10. Klein S.C. An alternatively spliced interleukin 4 form in lymphoid cells / S.C. Klein, J.G. Golverdingen, A.G. Bouwens [et al.]// Immunogenetics. -1995. - V. 41, № 1. - P. 57.
11. Orsini B. Helicobacter pylori cag pathogenicity island is associated with reduced expression of interleukin-4 (IL-4) mRNA and modulation of the IL-4delta2 mRNA isoform in human gastric mucosa / B. Orsini, B. Ottanelli, A. Amedei [et al.] // Infect. Immun. - 2003. - V. 71, № 11. - P. 6664-6667.
12. Peschell C. Effects of B-cell stimulatory factor interleukln-4 on hematopoietic progenitor cells / C.Peschell, W. E. Paul, I. Ohara, I. Green // Blood. - 1987. - V. 70, № 1. - P. 254-263.
13. Pouliot P. Interleukin-4 production by human alveolar macrophages / P. Pouliot, V. Turmel, E. Gelinas [et al.]// Clin. Exp Allergy. -2005. - V. 35, № 6. - P. 804-810.
14. Ptitsyn L.R. Production of recombinant hIL-4delta2-a native isoform of human interleukin-4 in Escherichia coli cells / L.R.Ptitsyn, S.V. Smirnov, I.B. Altman [et al.] // Bioorg Khim. -1999. - V. 25, № 8. - P. 623-629.
15. Romagnani S. Regulatory role of IL-4 and other cytokines in the function and development of human T cell clones / S. Romagnani // Res. Lmmunol. -1993. - V. 144, № 8. - P.625-628.
16. Seah G.T. Interleukin-4 and its alternatively spliced variant (IL-4delta2) in patients with atopic asthma / G.T. Seah, P.S. Gao, J.M. Hopkin [et al.] // Am. J. Resp. Crit. Care. Med. -2001. - V. 164, № 6. - P.1016-1018.
17. Sakkas L.I. Increased levels of alternatively spliced interleukin 4 (IL-4delta2) transcripts in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic sclerosis / L.I. Sakkas, C. Tourtellotte, S. Berney [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1999. - V.6, № 5. - P.660-664.
18. Sorg R.V. Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2 / R.V. Sorg, J. Enczmann, U.R. Sorg [et al.]// Experimental Hematology. -1993. - V.21, № 4. - P.560-563.
19. Vasiliev A.M. Structural and functional properties of IL-4?2, an alternative splice variant of human IL-4 / A. M. Vasiliev, R. N. Vasilenko, N. L. Kulikova [et al.]// J. Proteome Res. -2003. - V.3, № 3. - P.273-281.
20. Zavyalov V.P. Molecular model of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4delta2, a naturally occurring inhibitor of IL-4-stimulated T cell proliferation / V.P. Zavyalov, A.I. Denesyuk, B. White [et al.]// Immunol Lett. -1997. - V.58, № 3. - P.149-152.